超多指标HyperView™技术文档
* 图示：胃癌（GC）肿瘤间质Panel3（蓝/DAPI、白/aSMA、绿/CD31、紫/CD3、青/panCK、红/CD11b、黄/FAP）。该染色panel 显示胃癌肿瘤细胞侵袭边缘，aSMA+成纤维细胞（白色）分割肿瘤组织与正常腺体组织，成纤维细胞形成物理屏障阻断抑制肿瘤侵袭生长的，同时CD3+T淋巴细胞（紫色）向肿瘤内的浸润路径也被阻断。另一方面，紧邻肿瘤边界的成纤维细胞转变为aSMA+FAP+的激活成纤维细胞（黄色）（CAFs），该类型的成纤维细胞与具有免疫抑制作用的CD11b+髓系免疫细胞（红色）有显著的空间重叠关系。
【背景介绍】
肿瘤免疫微环境（tumor immune microenironment, TIME）组成复杂，其包含了肿瘤组织内的肿瘤细胞，各类免疫细胞，间质细胞以及胞外基质等。肿瘤病人个体免疫微环境内的各种细胞成分，功能以及空间分布特征，对于肿瘤进展预后以及免疫治疗效果具有重要指示意义。肿瘤微环境中的调节性T细胞（Treg），肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）以及指示高VEGF表达的高密度内皮细胞（ECs）等，对免疫微环境具有很强的抑制作用，往往预示了病人预后不佳。而微环境中聚团的CD8+PD1+ T细胞，PDL1高表达的炎症细胞/肿瘤细胞，以及三级淋巴结结构（TLS）则往往预示良好的免疫治疗反应。同时，个体肿瘤免疫微环境也并不稳定，其受肿瘤突变，新的转移组织微环境，以及肿瘤治疗方案的影响，一直处于动态变化中。因此，为了能可视化肿瘤免疫微环境中各细胞组分及空间分布特征，LuminIRIS 公司开发了HyperView Cyclic mIF循环多重免疫染色技术，用以标记并识别免疫微环境中各种免疫相关细胞。
（Rapid, inexpensive, high-plex microenvironmentand biomarker profiling of tissue with any antibody.）
【技术特征】
1、高效率HyperView免疫染色技术：
传统多色免疫荧光染色过程中，为了使特异抗体染色具有足够的荧光亮度，一般抗体孵育时间较长，且使用的抗体浓度很高。
* 图示：非小细胞肺癌（NSCLC）石蜡切片样本免疫荧光染色，CD11c（树突细胞标记）（1:1000浓度）。（左）常规免疫荧光染色（一抗25℃孵育20min）；（右）HyperView免疫染色技术（一抗25℃孵育20min）。
2、背景荧光去除技术（fluorescent-quencher）：
石蜡切片会因为醛类试剂的固定及高温处理等原因，会导致样品组织及组织内红细胞等产生显著的自发荧光，进而干扰特异荧光标记。
* 图示：非小细胞肺癌（NSCLC）连续切片样本，双色免疫荧光平行染色，绿色（CD68），红色（ki67）；（左）对照切片具有显著的背景自发荧光；（右）切片经过fluorescent-quencher预处理10min。
* 图示：卵巢癌（OC）连续切片样本，双色免疫荧光平行染色，绿色（PDL1），红色（CD8）；（左）对照切片中大量血细胞具显著背景荧光；（右）切片经过fluorescent-quencher预处理10min。
3、抗体剥离技术（Antibody Stripping）：
传统的多色免疫荧光染色（multiplexIF）要求使用来自不同种属（小鼠，大鼠及兔等）或不同种型（IgG及IgM等）的单个抗体孵育组织切片。之后针对每一种一抗配合使用特异反应的荧光偶联二抗标记。为了避免交叉，该方法对抗体种属配合要求苛刻。
* 图示：温和的抗体剥离技术可在细胞爬片上实现同种属抗体的顺序染色。（左）未经过抗体剥离液处理，多色染色出现荧光交叉。（右）经过抗体剥离处理（20min），多色染色荧光相互不干扰。
* 图示：温和的抗体剥离技术可在石蜡切片上实现同种属抗体的顺序染色。在同一张宫颈癌（Cervical Cancer）石蜡切片上使用三种兔来源一抗实施多色顺序染色，结果相互不串扰。
4：差异荧光淬灭技术（Differential Fluorescence quenching）：
* 图示：对小鼠肾石蜡切片的多色染色样片实施局部差异光淬灭（20min），ROI i淬灭区域；ROI ii：未淬灭区域。
5：单细胞水平配准技术（accurate co-registration）：
* 图示：（A）不同轮次间染色循环中，差异荧光淬灭会保留Dapi，可以提取到精准的特征点，计算出配准策略；（B）将配准策略应用到不同轮次的Dapi通道，精度达到单细胞级（第1轮赋予红色，第2轮绿色，黄色即表示完全重叠）；（C）将高精度配准策略应用到所有切片、轮次、通道；（D）将配准变换后的所有通道进行融合，即可获得超多指标染色图像，用作定性、定量、定位分析。
6：基于计算机视觉的人工智能病理数据分析技术（CV based AI analysis）：
多重免疫染色（mIF）的图像数据量很大，多通道（≥7）的多色荧光图能在（1cmX1cm）的切片范围内，识别数十万不同种类的免疫细胞。基于计算机视觉（CV）的人工智能（AI）病理数据分析对于系统的理解肿瘤微环境中各种免疫细胞的组成，分布以及空间特征具有重要意义。
* 图示：（左）病理学家判断主导的AI细胞识别训练逻辑；（右）基于训练的AI对多色染色数据图进行自动化细胞分割以及识别。